JWH018 ein gemeinsamer Bestandteil der "heiße" Kräutermischungen, ist ein wirksamer und wirksam Cannabinoid-CB1-Rezeptor-Agonisten

JWH018 ein gemeinsamer Bestandteil der "heiße" Kräuter-Mischungen, ist ein wirksamer und wirksam Cannabinoid-CB1-Rezeptor-Agonisten

AbstraktHintergrund und Ziel:"Spice" ist eine Kräutermischung in erster Linie in Europa als mildes Halluzinogen mit prominenten Cannabis-ähnliche Effekte und als legale Alternative zu Cannabis vermarktet. Doch ein aktueller Bericht identifiziert eine Reihe von synthetischen Zusatzstoffen in Proben von "Spice". Eine davon ist das Indolderivat JWH018, einem Liganden für den Cannabinoid-Rezeptor 1 (CB1) Cannabinoid-Rezeptor und hemmt cAMP-Produktion in CB1-Rezeptor-exprimierenden CHO-Zellen. Andere Auswirkungen auf JWH018 CB1-Rezeptor-vermittelte Signalisierung nicht bekannt sind, insbesondere in Neuronen. Hier haben wir die Signalwege von JWH018 an CB1-Rezeptoren aktiviert ausgewertet.Experimentellen Ansatz:Wir untersuchten die Wirkung von JWH018 auf Neurotransmission in kultivierten autaptic Hippocampusneuronen. Wir weiter analysiert seine Aktivierung von ERK1 / 2 Mitogen aktivierte Proteinkinase (MAPK) und Internalisierung von CB1-Rezeptoren in HEK293-Zellen, die diesen Rezeptor.Die wichtigsten Ergebnisse:In kultivierten hippocampalen Neuronen autaptic, JWH018 inhibiert exzitatorischen postsynaptischen Ströme (IC50 = 14,9 nM) in einer Konzentration-und CB1-Rezeptor-abhängigen Weise. Außerdem erhöht es ERK1 / 2 MAPK Phosphorylierung (EC50 = 4.4 nm). Wir fanden auch, dass JWH018 potently induzierte schnelle und robuste CB1-Rezeptor-Internalisierung (EC50 = 2,8 nM; t1 / 2 = 17,3 min).Schlussfolgerungen und Implikationen:JWH018, ein prominenter Bestandteil mehrerer pflanzliche Zubereitungen für ihre Psychoaktivität vermarktet wird, ist ein potenter und wirksame CB1-Rezeptor-Agonisten, die mehrere CB1-Rezeptor-Signalwege aktiviert. Somit ist es wahrscheinlich, dass die subjektiven Wirkungen von "Spice" aufgrund der Aktivierung von Cannabinoid-CB1-Rezeptoren durch JWH018 sind, aufgenommen zu dieser pflanzliches Präparat.Keywords: Spice, JWH018, Cannabinoid-CB1-Rezeptor, Internalisierung, ERK1 / 2, MAPK, Neurotransmission, Marihuana, THCEinführungCannabis sativa (Cannabis, Marihuana oder Haschisch) ist ein weit verbreitetes Medikament mit namhaften Psychoaktivität sowie potenzielle medizinischen Wert. Δ9-Tetrahydrocannabinol (THC) als wichtigste psychoaktive Bestandteil von C. sativa identifiziert worden, obwohl es nur eine von einer Reihe von bioaktiven Phytocannabinoiden in der Anlage gefunden. Die physiologischen Wirkungen von THC wurden gut beschrieben.Der Cannabinoid-Rezeptor 1 (CB1) Cannabinoid-Rezeptor hat als Rezeptor, der die Auswirkungen auf das Verhalten von THC vermittelt in Tieren und wahrscheinlich tut dies beim Menschen identifiziert worden. Der CB1-Rezeptor wird vorwiegend im ZNS exprimiert, insbesondere in Bereichen wie dem Hippocampus, Basalganglien, Kortex, der Amygdala und dem Kleinhirn - Bereiche im Zusammenhang mit Verhaltensweisen, die von THC beeinflusst. An der subzellulären Ebene sind CB1-Rezeptoren in erster Linie auf Axonterminalen, eine erstklassige Lage, um Neurotransmission beeinflussen gefunden. Der CB1-Rezeptor ist ein G-Protein-gekoppelten Rezeptor (GPCR), die Paare der Gi / o-Klasse von G-Proteinen und als solche auf Agonistenaktivierung auf eine Hemmung der Adenylatzyklase und anschließende Abnahme der zellulären cAMP-Niveaus führt. CB1-Rezeptor-Aktivierung hemmt auch Spannung Kalziumkanäle und aktiviert einwärtsgleichrichtenden Kaliumkanäle. Kumuliert diese Effekte auf intrazelluläre Signalwege führen zu einer verminderten zellulären Erregbarkeit und aufgrund seiner Nähe zum synaptischen Terminals, in einer Verringerung der Wahrscheinlichkeit von Neurotransmitter-Freisetzung. Diese Fähigkeit, Neurotransmission hemmen können beide exogene Cannabinoid-Agonisten (zB THC) und endogene Cannabinoide (Endocannabinoide), um eine tief greifende Auswirkungen auf die neuronale Kommunikation haben. Wie CB1-Rezeptoren auf glutamatergen und GABAergen beide Anschlüsse zu finden sind, kann ihre Aktivierung zu unterdrücken sowohl hemmende und erregende synaptische Übertragung.CB1-Rezeptor-Stimulation auch zu einer Aktivierung von Mitogen-aktivierten Proteinkinase (MAPK), insbesondere extrazelluläre Signal-regulierte Kinase (p42/44 oder ERK1 / 2). MAPK Aktivierung resultiert in der Phosphorylierung der beiden nuklearen Transkriptionsfaktoren und anderen cytosolischen Ziele, die zu Veränderungen in der Transkription, Übersetzung, Zellmotilität, Form, Proliferation und Differenzierung führen. Darüber hinaus in Reaktion auf anhaltende Aktivierung ist CB1-Rezeptor Signalgebung unterliegen der Regulierung durch Rezeptor-Desensibilisierung und Internalisierung. Desensibilisierung wird gedacht, um von Phosphorylierung von spezifischen Rückstände von GPCR-Kinasen was Entkopplung des Rezeptors vom G-Protein-Komplexe Signalisierung führen. Im Gegensatz dazu erfolgt die Internalisierung über Translokation des Rezeptors durch Endozytose Maschinen Endosomen. Internalisierten Rezeptoren werden anschließend an die Plasmamembran oder abgebaut zurückgeführt."Spice" ist eine Kräutermischung, vor allem in Europa für seine Cannabis-ähnliche Effekte und als Alternative zu Marihuana vertrieben. Ein kürzlich veröffentlichter Bericht verwendet Gaschromatographie / Massenspektrometrie, um eine Reihe von verschiedenen "Spice"-Zubereitungen sowie konkurrierenden Produkten anderer Hersteller zu analysieren. Interessanterweise fügt diese Kräuter "Spice" enthaltenen vielfältigen synthetisches Cannabinoid Zusatzstoffe. Gemeinsame zwischen den verschiedenen Präparaten war JWH018, ein Cannabinoid-Agonist aus der aminoalkylindole Familie. JWH018 wurde gezeigt, dass eine verbindliche Affinität für CB1-Rezeptoren im niedrigen nanomolaren Bereich (~ 9 nm) haben. In CB1-Rezeptor-exprimierenden CHO-Zellen hemmt JWH018 Forskolin-stimulierte cAMP-Produktion mit einer EC50 von 14,7 nm mit einer maximalen Hemmung von 79%. Darüber hinaus gab es keine Berichte über die Wirkung auf JWH018 CB1-Rezeptor-vermittelten zellulären Signalübertragung. Es hat einen einzigen Bericht zu der Auswirkungen auf das Verhalten von JWH018 Behandlung gefunden bisher, dass die JWH018 tetrad von Verhaltensweisen klassisch mit Cannabinoiden (Analgesie, Katalepsie, hypomotility und Hypothermie) assoziiert produziert, mit ED50-Werte im Bereich von einem Tiefstand von 0,09 mg · kg- 1 zur Analgesie auf einen Höchststand von 1,47 mg · kg-1 für Unterkühlung im Nagetier-Modell, was darauf hindeutet, dass JWH018 CB1-Rezeptoren in vivo aktiviert.
JWH018 vermindert die Freisetzung von Neurotransmittern durch Aktivierung präsynaptischen CB1-Rezeptoren. (A) Chemische Struktur von JWH018. (B) JWH018 konzentrationsabhängig verringert EPSC Ladung (n = 8 bis 14 für jede Konzentration getestet). Diese hemmende Wirkung wurde umgekehrt ...Basierend auf bisherigen Erkenntnissen, dachten wir, es war wahrscheinlich, dass JWH018 würde als Agonist in andere CB1-Rezeptor-vermittelte Signalwege zu handeln und versucht, seine Fähigkeit, als solche funktionieren zu charakterisieren. Wir untersuchten die Wirkung von JWH018 auf Neurotransmission und ERK1 / 2 MAPK-Aktivierung und seine Fähigkeit, CB1-Rezeptor-Internalisierung zu erzeugen. Wir fanden, dass JWH018 sowohl ein potenter und eine wirksame CB1-Rezeptor-Agonisten in jedem dieser Bereiche, Aktionen ist, dass wahrscheinlich erklären, die Fähigkeit des "Spice"-Zubereitungen, Marihuana-ähnliche Effekte zu erzeugen.MethodenZellkultur und TransfektionAlle Tierpflege und experimentellen Verfahren in dieser Studie verwendet wurden von den Animal Care Ausschüsse der Indiana University zugelassen und entsprechen den Richtlinien des National Institutes of Health auf die Pflege und Verwendung von Tieren. Mouse (CD1 Belastung und GAD67-GFP) hippocampalen Neuronen der CA1-CA3 Region isoliert wurden Mikro-Inseln kultiviert, wie zuvor beschrieben. Keine signifikanten Unterschiede zwischen den Neuronen von beiden Dehnung bei jedem Medikament getesteten Konzentration isoliert gefunden wurden, wurden so die Daten aus beiden Stämmen vereinigt. Neuronen wurden von Tieren (bei postnatalen Tag 0-2, über schnelle Enthauptung ohne Betäubung getötet) erhalten und überzogen auf eine Feeder-Schicht von Hippocampus-Astrozyten, die festgelegt hatte zuvor gelegt. Die Kulturen wurden in High-Glucose gewachsen (20 mM) Minimum Essential Medium mit 10% Pferdeserum, ohne Mitoseinhibitoren und für Aufnahmen nach 8 Tagen in der Kultur und für nicht mehr als 3 h nach der Entnahme aus dem Kulturmedium. Alle elektrophysiologischen Experimente wurden ausschließlich auf exzitatorischen Neuronen durchgeführt. Alle Medikamente wurden Zellen von mindestens zwei verschiedenen getesteten Präparationen.Zelllinien stabil exprimieren CB1-Rezeptoren wurden wie zuvor beschrieben. Stabile Klone gleichmäßig CB1-Rezeptoren exprimieren, wurden ausgebaut und zur Internalisierung und MAPK-Assays. Die Zellen wurden in Dulbecco-modifiziertem Eagle-Medium mit 10% fötalem Kälberserum und Penicillin / Streptomycin (GIBCO, Carlsbad, CA, USA) bei 37 ° C in 5% CO2.ElektrophysiologieWenn ein einzelnes Neuron auf einer kleinen Insel von permissiven Substrat gezüchtet wird, bildet es Synapsen - oder "-autapses' auf sich. Alle Experimente wurden an isolierten autaptic Neuronen durchgeführt. Whole-cell, Voltage-Clamp-Aufnahmen aus autaptic Neuronen wurden bei Raumtemperatur durchgeführt unter Verwendung eines Axopatch 200A Verstärker (Axon Instruments, Burlingame, CA, USA). Die extrazelluläre Lösung enthielt (mM) NaCl 119, KCl 5, 2 CaCl2, MgCl2 1, Glucose und 30 HEPES 20. Kontinuierlicher Lösung durch das Bad Kammer (2 mL · min-1) gewährleistet schnelle Drug Application und Clearance. Drogen wurden in der Regel als eine Aktie dann in extrazellulären Lösung an ihrem endgültigen Konzentration verdünnt und am selben Tag zubereitet. Recording Pipetten 1.8-4 MOhm wurden mit Lösung gefüllt (mM): Kaliumgluconat 121,5, KCl 17.5, NaCl 9, 1 MgCl2, 10 HEPES, EGTA 0,2, 2 und MgATP LiGTP 0,5. Zugangswiderstand wurde überwacht und nur Zellen mit einem stabil Zugangswiderstand wurden zur Datenanalyse enthalten.Das Membranpotential wurde bei -70 mV und exzitatorischen postsynaptischen Ströme (EPSCs) gehalten wurden alle 20 s durch das Auslösen einer Aktion ausgespannt Strom mit einem 1,0 ms depolarisierenden Schritt hervorgerufen. Die resultierende Wellenform evozierte bestand aus einer kurzen Stimulus Artefakt (dh eine große Abwärtsspitze darstellt innen Natrium-Ströme) durch die langsamere EPSC gefolgt. Die Größe der aufgezeichneten EPSCs wurde durch die Integration der evozierten Strom gebührenfrei (im PC) ergeben berechnet. Berechnung der Gebühr auf diese Weise ergibt sich ein indirektes Maß für die Menge der Neurotransmitter-Freigabe bei gleichzeitiger Minimierung der Auswirkungen der Verzerrung auf Kabel Ströme vom Ort der Aufnahme-Elektrode (die Soma) erzeugt. Die Daten wurden bei einer Abtastrate von 5 kHz erfasst.Depolarization Unterdrückung der Anregung (DSE) ist ein Prozess, bei Depolarisation eines Neurons führt zur Herstellung endocannabinoids und Aktivierung der präsynaptischen Rezeptoren CB1 mit anschließender vorübergehende Abnahme der Glutamat-Freisetzung und EPSC Amplitude. Kultivierte autaptic Neuronen sind heterogen, mit einigen CB1-Rezeptoren exprimieren, und andere nicht. Die Anwesenheit von DSE (was CB1 Rezeptoren) wurde als Marker für neuronale Cannabinoid Empfindlichkeit verwendet. DSE induziert wurde, wie zuvor beschrieben. Aufnahmen waren in erster Linie (siehe Ergebnisse) aus Zellen, die DSE ausgestellt.Um die Website von JWH018 ihrem Handeln auf Neurotransmission, gepaart Pulsverhältnis Analyse zu bestimmen, wurden Miniatur EPSC (mEPSC) Aufnahmen und Messungen der Veränderungen in der Variationskoeffizient (CV) durchgeführt. Gekoppelte Impuls-Verhältnisse als die Ladung des ersten von zwei Impulsen (60 ms Intervall) durch das zweite dividiert. Ratios kleiner als 1,0 wurden als gepaarten Puls Depression interpretiert. Die Analyse wurde nur auf Neuronen, die gepaart Puls-Depression unter basalen Bedingungen angezeigt, die angibt Neuronen mit hoher Wahrscheinlichkeit der Freisetzung durchgeführt. Ratios wurden für jedes Neuron unter basalen und Medikament behandelten Bedingungen berechnet.mEPSC Analyse wurde durch Messung der Frequenz (Hz) und Amplitude (pA) von mEPSC Veranstaltungen unter basalen und Medikament behandelten Bedingungen durchgeführt. mEPSC Ereignisse wurden ohne Kenntnis der Behandlungen analysiert und dann die Daten von jedem Zustand wurden gepoolt. Grundstücke, kumulative Wahrscheinlichkeit und Grafiken der mittleren mEPSC Frequenz und Amplitude wurden aus dieser gepoolten Daten gemacht.Mittelwerte und Variationskoeffizienten wurden 6 bis 20 Sweeps von Basal-und Arzneimittel behandelten Bedingungen berechnet. π und r wurden für jedes einzelne Experiment und berechneten ± SEM wurden jeweils berechnet. Ein präsynaptischen Seite der Droge Politik zur synaptische Depression wurde, wenn r <π <1 abgeleitet.MAPK und Rezeptor-Internalisierung AssaysMAPK-Aktivierung wurde wie zuvor beschrieben, mit einigen Modifikationen analysiert. HEK293-Zellen, die CB1-Rezeptoren wurden auf Poly-D-Lysin-beschichtete 96-Well-Platten ausplattiert (Corning, Corning, NY), läßt auf ~ 95% Konfluenz kultiviert. Am folgenden Tag das Wachstumsmedium entfernt und ersetzt wurde durch serumfreies Wachstumsmedium und die Zellen wurden über Nacht inkubiert. Die Zellen wurden einmal mit HEPES-gepufferter Salzlösung (HBS, 130 mM NaCl, 5,4 mM KCl, 1,8 mM MgCl2 und 10 mM HEPES, pH 7,5) gewaschen, die 0,2 mg · ml-1 Rinderserumalbumin (BSA). Arzneimittel enthaltenden Lösungen wurden in der HBS / BSA-Lösung hergestellt und in die Vertiefungen an geeigneten Zeitpunkten. Nach Medikament Inkubation wurden die Vertiefungen geleert und eiskalter 4% Paraformaldehyd wurde sofort in jede Vertiefung gegeben, und die Platten wurden auf Eis für 15 min nach 30 min bei Raumtemperatur gegeben. Die Paraformaldehyd wurde dann entfernt und mindestens 100 ul eiskaltem Methanol wurde zu jeder Vertiefung zugegeben und die Platte wurde bei -20 ° C für mindestens 20 min inkubiert. Für Methanol Inkubationszeit kürzer als eine Stunde wurde ein zusätzlicher Waschschritt unter Verwendung von Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS; 137 mM NaCl, 10 mM NaH2PO4, 2,7 mM KCl, pH 7,4), enthaltend 0,1% Triton X-100 für 25 min. Das Methanol oder PBS / Triton X-100 wurde mit einer blockierenden Lösung von Tris-gepufferter Salzlösung (TBS; 137 mM NaCl, 10 mM Tris, pH 7,4) ersetzt, das 5 mg · ml-1 BSA resuspendiert und für mindestens 1 h bei Raumtemperatur. Die Blockierungslösung wurde dann entfernt und durch eine blockierende Lösung, die Kaninchen-Anti-phospho-ERK1 / 2 MAPK-Antikörper (1:200) (Zelle Signaling Technologies Inc., Danvers, MA) und durfte Schütteln über Nacht bei 4 ° C oder für 3 h bei Raumtemperatur gerührt. Die Antikörperlösung wurde entfernt und die Platten wurden fünfmal mit TBS, enthaltend 0,05% Tween-20 (TBST) für 5-15 min gewaschen. Eine Lösung, die eine Blockierung IRDye konjugierten Anti-Kaninchen-IgG-Antikörper [entweder Esel anti-Kaninchen IR800 (1:500 Verdünnung) oder Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG IR680 (1:200) Antikörper (LI-COR Biosciences, Lincoln, NE)] war zugegeben und für 1 h bei Raumtemperatur schütteln. Die Platten wurden dann fünfmal mit TBST, 5-15 min jedes Mal, mit einem letzten schnellen einzigen Spülung in destilliertem Wasser gewaschen. Die Platten wurden trocken getupft und dann gescannt mit einem LI-COR Odyssey. Integrierte Intensitäten wurden pro Vertiefung verwendet. Die Menge des MAPK-Aktivierung wurde als die durchschnittliche integrierten Intensitäten der Medikamenten behandelten Vertiefungen durch den durchschnittlichen integrierten Intensitäten der unbehandelten Brunnen dividiert und als Prozentsätze ausgedrückt.Das Ausmaß der CB1-Rezeptor-Internalisierung wurde analysiert, wie zuvor in. Das Ausmaß der Internalisierung wurde als die durchschnittliche integrierten Intensitäten der Medikamenten behandelten Vertiefungen durch den durchschnittlichen integrierten Intensitäten der unbehandelten Brunnen dividiert und als Prozentsätze ausgedrückt beschrieben.DatenanalyseDie Daten sind als Mittelwert ± SEM berichtet (außer EC50, IC50 und t1 / 2 Daten, die als Mittelwert ausgewiesen werden ± 95% CI). Nicht-lineare Regression wurde verwendet, um die Konzentrations-Reaktions-Kurven und den zeitlichen Verlauf der Internalisierung passen. Gepaart Student-t-Tests wurden verwendet, um die Wirkung von Medikamenten auf gepaart Puls Verhältnisse und mEPSC Daten und ungepaarten Student-t-Tests wurden auf allen anderen Vergleich Analysen auszuwerten. Statistische Signifikanz wird wie folgt angezeigt: *** P <0,0001, ** P <0,01 und * P <0,05. Alle Grafiken und statistische Analysen wurden unter Verwendung von GraphPad Prism 4.0 Software (Hearne Scientific Software, Chicago, IL, USA).MaterialienDrogen und Reagenzien wurden von Tocris Cookson (Ellisville, MO, USA), Cayman Chemical (Ann Arbor, MI, USA) oder Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA) erworben. JWH018 wurde wie von Huffman beschrieben. Heterozygote (CB1 + / -)-Mäusen zu unserer Kolonie zu gründen wurden großzügig von Dr. Catherine Ledent (Universität Brüssel, Belgien) zur Verfügung gestellt. GAD67-GFP Mäusen durch Dr Yuchio Yanagawa (Gunman University, Gunma, Japan) generiert wurden von Dr. Albert Berger (University of Washington, Seattle, WA, USA) zur Verfügung gestellt und werden mit Dr Yanagawa Erlaubnis. Rimonabant (SR141716) wurde vom National Institute of Drug Abuse Medikamenten-Versorgung erhalten.ErgebnisseJWH018 verringert die Wahrscheinlichkeit von Neurotransmitter-Freisetzung über CB1-Rezeptor-AktivierungIm ZNS sind CB1-Rezeptoren vorwiegend auf Axonterminalen entfernt. Nach Agonistenbindung führt CB1-Rezeptor-Aktivierung zu einer reduzierten Wahrscheinlichkeit der Neurotransmitter-Ausschüttung. Um zu sehen, ob JWH018 wirkt ähnlich wie andere CB1-Rezeptor-Agonisten in diesem Zusammenhang haben wir EPSCs von glutamatergen autaptic Neuronenkulturen in Gegenwart und Abwesenheit von JWH018 aufgezeichnet. Autaptic neuronalen Kulturen sind gut charakterisierten Zubereitung, die eine einzelne Elektrode verwendet, um sowohl anregen und erfassen EPSCs (Beckers und Stevens, 1991). Wir fanden, dass JWH018 inhibiert EPSCs (Abbildung 1B, C) in einer Konzentration abhängigen Weise mit einem mittleren IC50 von 14,9 nM (4,8-45,9 nM, 95% CI) und eine maximale Hemmung von 48,0 ± 4,2% der Kontrolle bei 1 pM . Wie in 1C zu sehen, wurde die Hemmung durch JWH018 schlecht auf Auswaschung des Wirkstoffs aufgelöst. Allerdings wurde die Wirkung von JWH018 (1 uM) auf EPSC Ladung voll von 1 uM Rimonabant (1C), ein CB1-Antagonist umgekehrt, was darauf hindeutet, dass die begrenzte Auflösung aufgrund anhaltender Rezeptor-Besetzung ist. Die Wirkung auf JWH018 EPSCs wurde in Neuronen, die DSE, eine vorübergehende Verringerung der Größe EPSC ausgestellt untersucht, die sich aus Depolarisation. DSE ist eine gut beschriebene Verfahren, die gezeigt hat, dass abhängig von Cannabinoid Signalmoleküle einschließlich CB1-Rezeptoren. Wir fanden, dass in Neuronen, die nicht ausstellen DSE (und wahrscheinlich Mangel CB1-Rezeptoren); JWH018 hatte keinen Einfluss auf EPSC Größe (Daten nicht gezeigt). Um zu bestätigen, dass die Wirkung mit JWH018 beobachtet in der Tat war auf Maßnahmen auf CB1-Rezeptoren, behandelten wir Neuronen von CB1-Rezeptor-null Mäusen mit 1 uM JWH018. In Wildtyp-Neuronen, reduziert 1 uM JWH018 Behandlung EPSC Größe (Abbildung 1B), während in den CB1-Rezeptor-Neuronen null, hatte 1 uM JWH018 keine Wirkung (Abbildung 1B). Um festzustellen, dass JWH018 wurde durch präsynaptische CB1-Rezeptoren arbeiten, um die Wahrscheinlichkeit der Neurotransmitter-Freisetzung zu verringern, haben wir gepaart-Puls-Analyse unter Ausgangsbedingungen und während JWH018 Behandlung. 1D zeigt, dass 100 nM JWH018 Behandlung erhöht die gepaarten Puls-Verhältnis (P = 0,0056), was auf einen präsynaptischen Wirkort. Zur weiteren Validierung eines präsynaptischen Wirkort verzeichneten wir mEPSCs vor und nach der Behandlung JWH018. Behandlung von Neuronen mit 100 nM JWH018 verringert mEPSC Frequenz (1E, P = 0,031), aber nicht wesentlich verändert mEPSC Amplitude (1F, P = 0,19). CV Analyse weiter unterstützt eine präsynaptische Locus JWH018 Handeln (1G). 1 uM JWH018 Behandlung ergab eine mittlere Wert für r von 0,26 ± 0,049 und einem mittleren Wert von 0,54 π ± 0,41. Alle diese Maßnahmen stehen im Einklang mit einer präsynaptischen Seite der Droge Aktion so synaptische Depression. Zusammenfassend reduziert JWH018 die Wahrscheinlichkeit der Freisetzung von Glutamat in autaptic Neuronen durch Eingriffe in präsynaptischen CB1-Rezeptoren in einer Konzentration abhängigen Weise.JWH018 aktivierten MAPKZusätzlich zu modulieren Neurotransmission und cAMP-Spiegel aktiviert CB1-Rezeptor Signalgebung MAPK Aktivität in kultivierten Zellen (Bouaboula et al, 1995;.. Daigle et al, 2008) und Neuronen (Derkinderen et al, 2003.). Dies wird zweckmäßigerweise durch eine erhöhte Phosphorylierung von ERK1 / 2 nachgewiesen. Wie JWH018 aktivierten andere CB1-Rezeptor-vermittelte Signalwege wir die Hypothese, dass JWH018 würde auch aktivieren ERK1 / 2. HEK293-Zellen, die CB1-Rezeptoren wurden entweder mit JWH018 oder WIN55, 212, andere gut charakterisierte, wirksame CB1-Rezeptor-Agonisten behandelt. Der zeitliche Verlauf der ERK1 / 2 MAPK-Aktivierung für 100 nM jedes Arzneimittels bestimmt. Maximal Aktivierung aufgetreten zwischen 5 und 10 min von der Behandlung mit beiden Substanzen (Abbildung 2A). Interessanterweise sowohl auf 5 und 7,5 min JWH018 war ein wirksamer Aktivator von ERK1 / 2 Phosphorylierung. Ein Konzentrations-Wirkungs-Analyse wurde an der 7,5-Minuten-Zeitpunkt (2B) durchgeführt. JWH018 war stärker mit einer EC50 von 4,4 nM (1,6-12,5 nM) verglichen mit WIN55, 212, die eine EC50 von 69,9 nM (37,2 bis 131,4 nM) hatte. Die beiden Agonisten hatte ähnliche maximale Wirkung bei 1 uM, obwohl JWH018 war stärker als WIN55, 212. Darüber hinaus, um sicherzustellen, dass die MAPK-Aktivierung von diesen medikamentöse Behandlungen beobachtet CB1-Rezeptoren erforderlich ist, wurden die Zellen mit rimonabant und Agonisten behandelt. Hier verhindert 1 uM Rimonabant die Aktivierung von MAPK entweder 1 uM JWH018 oder WIN 55212 (JWH018: 97,1 ± 5,7%, WIN55, 212: 86,8 ± 5,8%, NS vs unbehandelt). Somit kann zusätzlich zu ihrer Hemmung der Adenylatzyklase und Neurotransmission JWH018 dient auch als potente Agonisten des CB1-Rezeptor-vermittelten ERK1 / 2 MAPK-Aktivierung.
Abbildung 2JWH018 Aktivierung von CB1-Rezeptoren stimuliert ERK1 / 2 MAPK Phosphorylierung. (A) 100 nM JWH018 Behandlung von CB1 exprimierenden HEK293-Zellen transient erhöhte ERK1 / 2 Phosphorylierung, ähnlich dem Zeitverlauf von 100 nM WIN55, 212 Aktivierung (4-6 ...JWH018-induzierte robust CB1-Rezeptor InternalisierungNach längerer Agonisten, unterziehen viele GPCRs Internalisierung. Es wird angenommen, ein Mittel, denen die Zelle ihre räumliche und zeitliche Reaktion auf Rezeptor-Agonisten (Drake et al, 2006.. Marchese et al, 2008) zu steuern. CB1-Rezeptor-Internalisierung wurde in Reaktion wurde zu zahlreichen Cannabinoid Drogen (. Coutts et al, 2001;. Daigle et al 2008. Hsieh et al, 1999) beschrieben. Wir vermuten, dass auf der Grundlage früherer Experimente, wenn JWH018 wurde als ein CB1-Rezeptor-Agonisten, die langfristige Behandlung von CB1-Rezeptor exprimierenden Zellen mit JWH018 zu tiefgreifenden Rezeptor-Internalisierung führen würde. 3A zeigt den zeitlichen Verlauf von CB1-Rezeptor-Internalisierung in HEK293-Zellen, die den Rezeptor. Nach 3 h Exposition gegenüber 100 nM JWH018, 38,1 ± 3,1% der CB1-Rezeptoren in der Plasmamembran unter basalen Bedingungen blieben auf der Zelloberfläche (61,9% Internalisierung). Wir wieder verwendet die gleiche Konzentration von WIN55, 212 als eine Kontrolle, bei der 3 Stunden der Behandlung führte zu 58,7 ± 3,2% Internalisierung (NS vs JWH018). JWH018 induzierte eine sehr viel schnellere Internalisierung als WIN55, 212 mit einer t1 / 2 von 17,3 min (13,6 bis 23,7 min), verglichen mit 39,6 min (26,2 bis 80,9 min) für WIN 55212. Jedes Medikament verursacht ähnliche maximal Ebenen der Internalisierung Erreichen Hochebenen von ca. 60% Internalisierung (JWH018 = 40,7 ± 1,8% der basalen Ebene; WIN55, 212 = 41,1 ± 4,9% der basalen Ebenen). Wir führten Konzentrations-Reaktions-Analyse der Internalisierung über eine 2 h Behandlungsdauer (3B). JWH018 und WIN55, hatte 212 ähnliche maximale Wirkung erreicht 54,7 ± 3,4% und 56,0 ± 3,0% bei 1 Internalisierung uM Konzentrationen bzw. (NS). Allerdings war JWH018 erneut die stärker mit einer EC50 von 2,8 nM (1,2-6,3 nM) verglichen mit WIN55, 212, die eine EC50 von 19,4 nM (8,5-44,4 nM) hatte. 1 uM Rimonabant verhindert Internalisierung von 1 uM der beiden Arzneimittel (JWH018: 91,5 ± 3,8%, WIN55, 212: 103,3 ± 3,3%, NS vs unbehandelt). Daher längerer JWH018 führt zu robusten CB1-Rezeptor-Internalisierung, ebenso wie die Behandlung mit WIN55, 212, obwohl JWH018 war stärker und schneller Internalisierung verursacht.
Abbildung 3JWH018 induziert CB1-Rezeptor-Internalisierung. (A) In CB1-Rezeptor exprimierenden HEK293-Zellen, 100 nM JWH018 Behandlung führte robust Rezeptor-Internalisierung, die schneller als die durch 100 nM WIN55, 212 (4-6 Parallelproben 5-10 induziert war ...DiskussionJWH018 ist eine gemeinsame synthetischen Additiv in unterschiedlichen Zubereitungen der Kräutermischung als "Spice" (Auwarter et al., 2009) bekannt gefunden. JWH018 wurde erstmals während einer Analyse cannabimimetische Indol-Strukturen, die zu neuen Indolen mit Effekten vergleichbar mit denen von natürlichen Cannabinoide wie THC (Huffman et al., 1994) entwickeln soll synthetisiert. Relativ wenig Charakterisierung dieses Liganden durchgeführt wurde. Es wurde berichtet, dass eine hohe Affinität für CB1-Rezeptor mit einem Ki von etwa 9 nm (Huffman et al, 1994. Showalter et al, 1996;. Chin et al, 1999;.. Aung et al, 2000) haben und inhibieren Adenylatcyclase mit einem IC50 von 14,7 nm und einer 79% maximale Inhibition. Über diese Vorstudien, gab es keine weiteren Untersuchungen JWH018 die Wirkung auf CB1-Rezeptor-vermittelte Signalisierung. Angesichts der Präsenz in "Spice" und seine Cannabinoid-like Psychoaktivität haben wir die Auswirkungen dieser Verbindung auf Neurotransmission MAPK Aktivität und CB1-Rezeptor Internalisierung untersucht.CB1-Rezeptor-Aktivierung unterdrücken kann Neurotransmission und die neuronale Erregbarkeit (Kano et al., 2009). 2007 ;); Hier haben wir autaptic erregenden Neuronen im Hippocampus als eine gut charakterisierte Modell-System von Cannabinoid-vermittelte Effekte auf Neurotransmission (Straiker und Mackie 2005 verwendet. Wir fanden, dass JWH018 potent hemmt Freisetzung von Glutamat in diesen Neuronen in einer Konzentration abhängigen Weise. Die Wirkung auf die synaptische Übertragung JWH018 war aufgrund seiner Tätigkeit an CB1-Rezeptoren als JWH018 hatte keinen Einfluss auf EPSC in Neuronen von CB1-Rezeptor-Knockout-Mäuse gezüchtet und Rimonabant, ein CB1-Rezeptor-Antagonist, blockiert seine Wirkung in Wildtyp-Neuronen. Darüber hinaus ist sehr wahrscheinlich JWH018 Schauspiel an präsynaptischen CB1-Rezeptoren auf ihrer Fähigkeit, die gepaarten Puls-Verhältnis zu erhöhen, um die Häufigkeit der mEPSCs ohne Beeinträchtigung mEPSC Amplitude zu verringern und die CV erhöhen basiert. Cannabinoid-Agonisten manchmal nicht verringern mEPSC Frequenz an glutamatergen Synapsen (Yamasaki et al., 2006). Allerdings sind unsere Ergebnisse hier im Einklang mit den meisten Berichten, die Cannabinoid-Unterdrückung mEPSC Frequenz (siehe Misner und Sullivan, 1999; Sullivan, 1999; Morisset und Stadtentwicklung, 2001; Robbe et al, 2001;.. Derbenev et al, 2004) zu finden, und der Unterschied kann in der Hirnregion, Zelltyp oder Kulturbedingungen liegen. Die Wirkung auf JWH018 Neurotransmission ist sowohl stark und effektiv mit einem IC50 von 14,9 nm und eine maximale Hemmung auf 48,0% der Kontrolle bei 1 nM. JWH018 exhibtied Wirkungen vergleichbar mit denen von WIN55, 212 (Straiker und Mackie, 2005). Angesichts der Internalisierung Daten kann JWH018 die Wirkung auf Neurotransmission potentiell Rezeptordesensibilisierung oder Internalisierung beeinflusst werden. Wir können keine bestimmte Rückschlüsse auf unsere Daten hier, ob Desensibilisierung hatte einen Effekt auf unsere Aufnahmen. Internalisierung ist unwahrscheinlich, dass eine Rolle so wenig CB1-Rezeptor Internalisierung würde bei Raumtemperatur während der 20-30 Minuten der Aufzeichnung auftreten zu spielen. Zusammenfassend hemmt JWH018 synaptischen Übertragung als ein potenter und wirksame CB1-Rezeptor-Agonisten.Basierend auf den oben diskutierten früheren Studien und unsere Feststellung, dass JWH018 synaptischen Neurotransmission gehemmt, schien es wahrscheinlich, dass JWH018 würde Signalisierung Effekte ähnlich denen von anderen CB1-Rezeptor-Agonisten zeigen. Allerdings war es wichtig, diese Hypothese zu testen, wie JWH018 eine andere funktionale Selektivität gegenüber anderen Cannabinoidagonisten (Urban et al., 2007) zeigen können. ERK1 / 2 MAPK-Aktivierung ist eine typische Folge der CB1-Rezeptor-Stimulation (Bouaboula et al, 1995;.. Daigle et al, 2008). Wir haben gezeigt, dass bei anderen Cannabinoid-Liganden wie WIN55, 212, JWH018 auch stimuliert ERK1 / 2 MAPK-Aktivierung in einer konzentrationsabhängigen Art und Weise beobachtet. Diese ERK1 / 2 Aktivierung hatte die typischerweise beobachtet rasche zeitliche Verlauf (Daigle et al., 2008) einen Höchststand erreicht Niveau der Aktivierung zwischen 5 und 10 min. Vergleicht JWH018 mit WIN55, 212, fanden wir, dass trotz einer ähnlichen zeitlichen Verlauf der Aktivierung JWH018 stärker mit einer EC50 von 4,4 nM war verglichen mit WIN55, 212 mit einer EC50 von 69,9 nM. Beide waren ähnlich wirksam.CB1-Rezeptor-Internalisierung wurde berichtet, dass in Reaktion auf eine Reihe von verschiedenen Cannabinoid-Liganden in einer Reihe von Zelltypen (Hsieh et al, 1999. Coutts et al, 2001;.. Daigle et al, 2008) erfolgen. Wir fanden heraus, dass JWH018, im Einklang mit der Fähigkeit als eine CB1-Rezeptor-Agonisten wirken, zu robusten CB1 Rezeptor-Internalisierung, die schnell ist (t1 / 2 = 17,3 min), potent (EC50 = 2.8 nM) und wirksam (38,1% der Grundfläche Ebenen bei 3 h mit 100 nM). Wir fanden es stärker und schneller als Internalisierung WIN55, 212 (EC50 = 19,4 nM und t1 / 2 = 39,6 min) zu induzieren. Allerdings sind die zwei Medikamenten ähnlicher Wirksamkeit (JWH018 - Plateaus bei 40,7% und WIN55, 212 - Plateaus bei 41,1% der Grundfläche Stufen). Somit verlängerte Engagement der CB1-Rezeptoren durch JWH018, wie bei vielen anderen CB1-Rezeptor-Agonisten führt zu tiefgreifenden zellulären Anpassungen, die dazu dienen, um zelluläre Empfindlichkeit gegenüber der Droge verringern können. Abschätzung der Auswirkungen von chronischer JWH018 auf das Verhalten berücksichtigen müssen seine Fähigkeit, zelluläre Desensibilisierung und Toleranz herzustellen.Bisher haben wir festgestellt, dass in autaptic neuronalen Kulturen, THC nicht hemmen EPSCs sondern antagonisiert es die Hemmung sowohl von WIN55, 212 und 2-Arachidonyl Glycerin (2-AG) (Straiker und Mackie, 2005). Ähnliche Ergebnisse wurden in nicht-autaptic Hippokampuskulturen (Roloff und Thayer, 2009) berichtet worden. In diesen Systemen THC wirkt effektiv als Antagonist mit kurzfristigen Behandlung, sondern desensibilisiert CB1-Rezeptor-Signal mit einer Langzeitbehandlung. Da THC, die die wichtigste psychoaktive Bestandteil von Marihuana ist, ist ein Low-Wirksamkeit CB1-Rezeptor-Agonist, spekulierten wir, dass es voll CB1-Rezeptor-Aktivierung verhindert durch die Endocannabinoid 2-AG und ahmt die Wirkung des niedrigen Wirksamkeit Endocannabinoid Anandamid (Straiker und Mackie, 2005). Dies war eine provokante These, die psychoaktive Wirkung von Marihuana zu erklären. Doch im Lichte der Erkenntnisse aus dieser Studie, muss diese Hypothese überprüft werden. "Spice" offenbar produziert Marihuana-ähnliche Psychoaktivität beim Rauchen (Auwarter et al., 2009). Es hat sich jedoch noch nicht gemeldet enthalten THC sondern mindestens ein potenter und wirksame CB1-Rezeptor-Agonisten. Deshalb, wenn die kognitiven Wirkungen von "Spice" aufgrund JWH018 sind, unsere These, dass die Psychoaktivität THC kann zum Teil aufgrund des Antagonismus von 2-AG Aktivierung von CB1-Rezeptoren erfordert Umdenken. Die Effekte, die wir zuvor mit THC beobachtet sein einzigartig in der kultivierten Neuronen Zubereitung vorhanden. In Kulturen, kann die Anzahl von CB1-Rezeptoren oder deren Kopplung beschränkt werden, was bewirkt, ein Low-Agonist Wirksamkeit als Antagonist wirken. Im Gegensatz dazu können diese Faktoren nicht für CB1-Rezeptoren in Gehirn exprimiert einschränkend sein, und eine geringe Wirksamkeit-Agonisten, wie THC als Agonist in vivo wirken. Alternativ kann, wie in einer aktuellen Studie vorgeschlagen wurde, kann der Unterschied auch in der Feuerrate der Neuronen liegen, das kann ein Neuron reagiert auf THC (Roloff und Thayer, 2009) beeinflussen. Darüber hinaus kann es eine Möglichkeit, dass es andere charakterisierte Zusatzstoffe in "Spice" dieses Einflusses Neurotransmission sein. Trotz dieser Unsicherheiten ist es klar, dass ein starker Inhibitor JWH018 Neurotransmission, mit einer Wirksamkeit vergleichbar mit anderen synthetischen Cannabinoide wie WIN55, 212.Unter den verschiedenen Zubereitungen von "Spice", die von Auwarter et al analysiert wurden. (2009), war JWH018 häufig Additiv. Hier haben wir gezeigt, dass die Behandlung JWH018 zellulären Effekte ähnlich denen der anderen wirksam Cannabinoid-Agonisten wie WIN55, 212 hat. Wir haben festgestellt, dass ein stärkeres JWH018 CB1-Rezeptor-Agonisten als WIN55, 212, obwohl eine ähnliche Wirksamkeit ist. Dies steht im Einklang mit den Berichten, dass "Spice" Marihuana-ähnliche Effekte hat, wenn geraucht wird. Während Auwarter et al. festgestellt, dass JWH018 nicht die häufigste der Additive in verschiedenen Gewürzzubereitungen, schlägt die hohe Wirksamkeit, daß sie Auswirkungen auf das Verhalten beim Menschen zu erzeugen. Die Selektivität für JWH018 CB1-Rezeptoren ist gering: JWH018 einen Ki von etwa 9 Nm bei CB1-Rezeptoren und eine Ki von etwa 3 nm bei CB2-Rezeptoren (Huffman et al, 1994; Chin et al, 1999; Aung et al... , 2000). Während die Effekte, die wir beobachtet eindeutig auf CB1-Rezeptor-Aktivierung, die potenzielle Rolle von CB2-Rezeptoren in den Auswirkungen von "Spice" erfordert weitere Studien. Diese Studie hat JWH018 fokussiert, jedoch unterschiedliche Zubereitungen von "heiße" enthalten offenbar verschiedene synthetische Zusätze, wie eine modifizierte Version des CP47, 497 (Verlängerung der Dimethylheptyl Seitenkette dimethyloctyl), einem Cannabinoid-Liganden, die auch als Agonisten wirken können an CB1-Rezeptoren, aber bisher noch nicht charakterisierte und HU210 (Huffman et al, 2008;.. Auwarter et al, 2009). Es ist wahrscheinlich, dass diese zusätzlichen Verbindungen können auch zu den Verhaltens-und subjektiven Wirkungen durch das Rauchen "Spice" produziert beitragen, und ihre unterschiedlichen Pharmakologien kann dazu führen, verschiedene Präparate von "Spice" in ihren Auswirkungen auf die Gesundheit oder Psychoaktivität variieren. Untersuchung dieser zusätzlichen synthetischen Zusatzstoffen erfordert weitere Aufmerksamkeit. Trotz dieser Vorbehalte haben wir gezeigt, dass JWH018 tiefe CB1-Rezeptor-vermittelte Effekte auf zelluläre Signalwege und Neurotransmission, die geeignet sind, einen erheblichen Einfluss auf die kognitive Funktion haben sind, hat. Somit ist "Spice", die als "natürlich" Kräutermischung vermarktet wird, tatsächlich ein Fahrzeug der Lieferung für mindestens eine sehr potente synthetische CB1-Rezeptor-Agonist, und seine Präsenz dürfte Konto für die psychoaktive Wirkung erzeugt, wenn "Spice" geraucht wird.GlossarAbkürzungen:CB1-RezeptorCannabinoid-Rezeptor 1CP47, 4972 - [(1R, 3S)-3-Hydroxy-cyclohexyl] -5 - (2-methyloctan-2-yl) phenolEPSCexzitatorischen postsynaptischen StromERKextrazelluläre Signal regulated kinaseGPCRG-Protein-gekoppelter RezeptorJWH018naphthalin-1-yl-(1-pentylindol-3-yl) methanonMAPKmitogen activated protein kinaseRimonabant
THCΔ9-TetrahydrocannabinolWIN55212-2Mesylat

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